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环境微生态 宏基因组测序 宏基因组测序

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       宏基因组学(Metagenomics),也称元基因组学,利用新一代高通量测序技术(NGS)以特定环境下微生物群体基因组为研究对象,在分析微生物多样性、种群结构、进化关系的基础上,可进一步探究微生物群体功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系,发掘潜在的生物学意义。与传统微生物研究方法相比,宏基因组测序技术规避了绝大部分微生物不能培养、痕量菌无法检测的缺点,因此近年来在环境微生物学研究中得到了广泛应用。

适用范围

      1. 医学领域:代谢病、肿瘤癌症等;

      2. 畜牧领域:肠道、瘤胃(如产甲烷菌类群)与动物健康/营养消化研究等;

      3. 农业领域:根际微生物与植物互作、农业耕作/施肥处理与土壤微生物群落等;

      4. 环境领域:雾霾处理、污水治理、石油降解、酸性矿水处理及海洋环境等;

      5. 生物能源:特殊功能的菌株、基因挖掘、工程菌的开发;

      6. 特殊极端环境:极端环境条件下的微生物类群研究。

美吉优势

       拥有标准化操作实验室和高通量测序技术平台,实验周期短,质量可靠。

       拥有 Illumina HiSeq 2500 和 HiSeq 4000 等多种高通量测序平台。

       拥有先进的拼接组装技术,全面高级的分析内容。

       技术人员经验丰富,可以根据合作伙伴要求提供宏基因组、多组学实验方案、解决实验问题、分析实验结果。

       拥有专业的生物信息团队和大型计算机,可以为合作伙伴提供个性化的生物信息分析服务。
       美吉生物利用各组学技术为客户在微生物领域发表文章300+篇,其中宏组学文章10+篇,累计影响因子1000+。

实验流程


生信分析流程图

技术参数


送样要求

土壤:10 g;粪便:3-5 g;血液:10 mL;污泥/沉积物:5-10 g

DNA:总量 ≥ 1 μg、浓度 ≥ 10 ng/μL1.8 < OD260/280 < 2.0

平台选择

 Illumina PE100/125/150

推荐测序量

肠道/粪便 > 3G;水体3-5G;土壤/污泥 > 8G


案例一:肠道微生物群区分痛风患者和健康人群

       痛风是由嘌呤代谢失调引起的一种自发性炎症疾病。尿酸是嘌呤代谢的终产物,尿酸盐在关节和关节周围组织中沉积,引起关节严重疼痛,诱发痛风。目前临床检测痛风的两个指标:1) 关节及关节周围组织尿酸盐沉积引发严重疼痛感;2) 血液中高尿酸含量(主要的检测指标)。但尿酸检测敏感度低,目前没有一个精准的诊断方法。目前已经了解到肠道微生物参与嘌呤和尿酸代谢,因此本研究利用微生物构建一种新型诊断痛风的高精准检测指标。


实验设计:

 

实验结果:


 

图1 痛风患者和健康人肠道菌群结构差异



 

图2 痛风患者肠道菌群分类学特征MGS分析

(共获得41MGS,其中疾病组19个,健康组22


 

图3 利用ROC分析检测基于属水平差异菌群作为预测模型区分痛风和健康人的准确性


图4 痛风患者肠道菌群COG功能预测


案例二:通过模拟升温揭示欧亚大草原对气候变化的正回馈作用

       温室气体增加导致气候变暖,一方面可能引起土壤微生物正向反馈,加速分解有机质释放更多的温室气体,另一方面土壤微生物可能适应于气候变暖,维持自身稳定甚至负向反馈。然而因为土壤有机质具有多种分解形式和缓慢的分解速率,因此对反馈模式的检测依然存在挑战。温度和降水量是影响陆地生态系统生物多样性和生态功能的关键因素,因此研究土壤微生物对其他生态系统类型,以及温度和降水量同时变化时的反馈非常重要。本研究通过建立温度和降水量模型,利用宏基因组技术研究土壤有机质转化相关基因的组成和相对丰度,同时检测了一系列土壤理化性质,以期准确检测微生物对环境变化的反馈模式。


实验设计:

1)实验分组:设置310 m × 15 m样方,并在每个样方内设置83 m × 4 m小样方(图1)。主要进行2种实验处理:1wateringW),在7-8月每周加入15 mm水,全年总计加入120 mm2warmingT),使用MSR-2420红外散热器连续加热,最终地表土壤温度上升约1.1℃

2)样本采集:随机选取小样方中4个位点采集土壤样本,并去除表层叶片,采样位点距离植物茎不少于2英尺,将4个位点的土壤混合成1个样本,并过2 mm筛去除植物根;

3)实验策略:检测土壤有机质含量、TNNH4+NO3-、含水量、pH和温度;对23个土壤样本进行宏基因组测序并筛选rRNA基因序列进行细菌和真菌群落的物种注释。


 


实验样地示例图

CTWWT分别代表对照组、warming组、watering组和warming+watering组)


实验结果:



图1 不同实验处理组土壤有机质降解相关基因相对丰度的Heatmap

 

图2 氮和硫代谢通路相关基因丰度差异示例图

图3 PERMANOVA分析实验处理对土壤微生物群落物种(a)和功能(b)组成的影响,及物种和功能组成之间的相关性(c


参考文献:

[1]Guo Z, Zhang J, Wang Z, et al. Intestinal Microbiota Distinguish Gout Patients from Healthy Humans[J]. Scientific reports, 2016, 6.

[2]Zhang X, Johnston E R, Li L, et al. Experimental warming reveals positive feedbacks to climate change in the Eurasian Steppe[J]. The ISME Journal, 2016.


(1)宏基因组测序总DNA的提取有哪些注意事项?

获得高质量的环境样品总DNA是宏基因组测序能否成功的关键。为了提取的DNA能够代表特定环境样品中的微生物种类,取样时必须严格遵循采样标准,尽量避免对样品的干扰,缩短保存和运输的时间,以尽可能地保持样品的微生物原貌。若要对功能基因簇进行研究,在提取DNA时,既要尽量完全地抽提出样品中的DNA,又要使获得的DNA保持较大的片段,因此在DNA提取时要在最大提取量和最小剪切力之间进行折中。


(2)采用Illumina高通量测序平台进行宏基因组测序,应如何构建文库?

从环境样品中提取总DNA后,进行测序文库制备,具体步骤如下:DNA随机打断成300bp的片段;DNA末端进行平滑化及修复处理;③3’末端加“A”碱基;④DNA两端加上“Y”型接头;PCR扩增进行文库模板的富集检测文库质量。

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