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基因表达调控 转录组 原核链特异性转录组

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        链特异性转录组是研究有参考基因组物种转录组的一种有效手段。相对于传统转录组测序而言,链特异性转录组可以确定两条链的转录方向,为基因的进一步注释和功能分析提供更准确的信息,同时还可以挖掘转录组中的non-coding RNA信息。原核生物链特异性转录组项目中,可以挖掘新的ncRNA与反义(antisense)转录本;还可以进行基因结构的研究,例如操纵子鉴定,为基因网络调控的研究提供有力支持。


美吉优势

★成熟稳定的实验流程保障实验结果的可重复性。

★强大的超级计算机平台搭配经验丰富的生信分析专家团队。

★从实验方案设计到后期数据挖掘,全面助力您的科学研究。


技术路线






菌体沉淀

        2-4ml (密度约1*107个/ml,对数期或稳定初期)

RNA样品

         1.请提供浓度≥100ng/μL,总量≥4μg的RNA(单次建库用量为2μg)

         2. OD260/ 280介于1.8 ~ 2.2之间,OD260/230≥2.0,RIN值≥6.5,23S:16S≥1.0,确保RNA无降解

         3.送样时请标记清楚样品编号,管口使用Parafilm膜密封

         4.样品保存期间切忌反复冻融

         5.送样时请使用干冰运输


案例一

        德氏乳杆菌保加利亚亚种2038(Lb. bulgaricus2038)是一种用作乳制品发酵剂的工业菌种。在这之前作者已经提出了一些关于它的工业特征的假设。现用RNA-seq来探究Lb. bulgaricus2038在乳清状态下4种不同生长时期的转录本情况。在这4个不同阶段中,表达量最丰富的基因主要参与翻译(对数生长期)、糖酵解(对照/滞后期)、乳酸形成(4个时期均高表达)和10-甲酰四氢叶酸形成过程(稳定期)。其中高表达的基因D-乳酸盐脱氢酶对产能具有重大影响,而EPS合成基因、限制修饰系统(RM)和CRISPR/Cas系统表达量一致则验证了该菌株在酸奶生产中的优势。文章推翻了之前一些假设,例如通过间隙循环生产的NADPH辅酶,可将天门冬氨酸转化为碳骨架中间体,通过降解GTP来促进甲酸的生产。另外研究还发现,解旋酶基因的高表达和氨基酸/寡肽转运蛋白的共表达揭示解旋酶可能调控菌株获得氮源环境。Lb. bulgaricus2038的运输系统可受反义RNA调控,预示ncRNA在乳酸菌基因表达中的具有潜在调控作用。研究初步揭示了Lb. bulgaricus2038的转录组信息,由此可对Lb. bulgaricus的调节系统有更好的理解并促进其工业应用。

1. 对转录本数据进行统计学分析得出mapping结果

        通过对4个不同阶段表达量的分析(RPKM)得出了每个生长时期前10个高表达量的基因,在此基础上着重分析LBU_1429等基因参与糖代谢过程。(Table 2)

表1 Lb. bulgaricus2038序列统计

表2 Lb. bulgaricus2038不同阶段高表达量的基因

2.不同样本差异基因表达分析

        热图展现了基因表达在相同通路中不同生长阶段的相关性(斯皮尔曼相关系数,Rvalue),明显可以看出大多数通路中基因表达呈现高度相关性(图2)。



图2 不同生长时期相同通路中基因表达存在相关性

3.蛋白酶和氨基酸转运系统基因的聚类分析

        研究表明,该菌株在早期生长阶段能够充分利用环境中的游离氨基酸,而在乳清培养条件下菌株后期生长主要依赖于寡肽,揭示了该菌株最为高效的氮源利用系统。(图3)


图3 蛋白酶和运输系统基因的系统聚类图

参考文献

Zheng H, Liu E, Shi T,et al.Strand-specific RNA-seq analysis of the Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus transcriptome.[J].Molecular Biosystems, 2015.

案例二:

        大肠杆菌O157:H7(EHEC)是一种常见的致病菌。本文使用SOLiD和Illumina测序仪通过链特异性RNA-seq方法研究该菌在11种条件下(生物及非生物)的转录情况。结果显示,对比SOLiD和Illumina测序结果发现:表达差异较大基因的测序结果具有极高的相关性。此外,通过热图分析2026种基因的转录情况,结果发现,在LB条件下上调和下调的基因没有在其它10种条件下形成调控群,该恶劣条件使得转录呈现巨大的差异。



图1 技术和生物学重复的对比

A . SOLID测序平台下的技术重复B. SOLID和Illumina测序平台的生物学重复



图2 差异表达基因的热图

参考文献:

Richard L, Svenja S, Steffen S,et al. Comparison of strand-specific transcriptomes of enterohemorrhagicEscherichia coliO157:H7 EDL933 (EHEC) under eleven different environmental conditions including radish sprouts and cattle feces[J].BMC Genomics, 2014, 15.



1)原核生物没有参考基因组能做转录组测序吗?

答:对于原核生物来说,由于其多顺反子的结构。如果从头拼接,无法确定基因的起始终止位置,必须有参考基因组提供位置信息。建议先做一个基因组扫描,用来作为参考。


2做纯菌转录组是否能得到细菌完整的代谢通路图?有些基因不知道是否表达?

答:细菌一般做基因组,基因的结构和位置都可以获得。细菌推代谢通路做基因组测序,做精细图和完成图,扫描图是不够的。


3对于原核生物的转录组,培养的单株菌是否还需要生物学重复。

答:研究原核生物纯菌,也是需要生物学重复的。一株菌不管培养出多少菌体,也只能反应这一株细菌的特点,因此需要设置重复。


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