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基因表达调控 转录组 PacBio三代全长转录组

PacBio三代全长转录组 生信分析 技术参数 案例解读 常见问题 留言咨询

       全长转录组测序是基于Pacbio单分子实时测序技术,借助其超长读长优势,无需组装,直接得到高质量的全长转录本信息的测序技术。其超长读长能够轻松跨越转录本从5’末端到3’PolyA尾的完整序列,从而实现对基因异构体、可变剪切、融合基因、基因全长的准确鉴定。


适用范围

        基因全长分析

        新转录本分析

        可变剪切分析

        融合基因分析

        基因结构优化

        等位基因分析


美吉优势

       丰富的经验,成熟的实验流程,可靠的数据保障;

       多种测序平台,灵活应用,优势互补;

       前沿的个性化生信分析;

       强大的运算能力。



产品优势:长读长,平均8-12kb,无GC偏向性;

送样要求:单次建库总RNA 4μg,浓度≥400ng/μl,OD260/280=1.6~1.8;

建库:全长cDNA文库,SMARTer技术反转录全长cDNA;

建库策略:常见分mRNA>1k和<1k,分别建库,每个文库测2-3个cell,具体视总RNA长度分布而定;

测序数据量:根据样本特点而定,一般6-8个cell。

 


       每个个体特定的转录组、转录形式和遗传变异,对于理解个体的生物过程和疾病非常重要。为了获得这样的信息,作者对淋巴细胞的3个家族成员进行了Pacbio三代测序。结果,首先,获得了多数的有足够表达量的≤3kb的转录本的所有剪切位点的信息。第二,定量了以前不能够定量的剪切异构体的表达量。第三,以de novo的方式鉴定了SNVs,定义了RNA单体型,同时也区分了等位基因的转录本结构以及鉴定其表达差异。这都与二代测序依靠短片段组装的方法有很大的不同。

 

图  BCKDK基因的可变剪切分析对比,全长转录组测序分析优势明显

A全长转录组分析,B深度二代illumina测序分析,C数据库原有注释

 

图  FCRLA基因的不同等位基因异构体序列分析。

三代测序使得等位基因结构鉴定更加精确。

 

参考文献

Hagen Tilgner, Fabian Grubert, Donald Sharona,et al. (2014) Defining a personal, allele-specific, and single-molecule long-read transcriptome.PNAS, 111(27), 9869-9874.


1.三代测序是不是能够同时分析基因结构和表达量?

       理论上是的。三代测序的长读长非常适合用来进行基因结构分析。但是表达量,客户需要考虑研究经费的问题,因为三代测序数据产出相对较低,而表达量计算需要相对较多的数据量,因此费用会比较贵。所以很多全长转录组的项目只进行基因结构方面的分析,而不考虑基因表达量的问题。


2.三代测序是不是有一定的错误率?

       是。它的单次读取的准确性相对二代测序要低,错误率通常在12%~15%左右。但是测到30×以上的话,准确性可以>99.999%。依然考虑错误率的话,可以通过二代测序进行碱基读取校正。目前三代测序最大的用途在于其长读长所带来的基因结构方面的分析优势。


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