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基因表达调控 非编码RNA circRNA测序

circRNA测序 生信分析 技术参数 案例解读 常见问题 留言咨询

       circRNA是一大类非线性RNA,作为调控因子发挥着巨大作用。circRNA具有大量存在,进化保守,在细胞质中相对稳定的特点。这使得circRNA具有许多的功能,例如作为miRNA的海绵,绑定RNA形成RNA-蛋白复合物,调控基因的转录。circRNA测序能够在整体水平上解释样品中circRNA的分类信息、表达量信息等,通过分析其与miRNA的互作关系探讨ceRNA调控机制。

 

适用范围

       1)作为ceRNA调控网络机制研究中的重要成员

       2)从全血中检测circRNA来研究circRNA是否可以作为未来疾病诊断的biomarker

 

技术优势

        采用核糖体去除、链特异性文库构建、以及RNase R消化方案,既能获取完整的环状RNA和线性RNA序列,也可以仅保留环状RNA序列。
        能够分析ceRNA调控机制。

组织样品

       1.动物组织:>2g;

       2.植物组织:>4g;

       3.细胞培养:>1*107个;

       4.血液样品:≥2ml。


 RNA样品

       1.请提供浓度≥ 200ng/μL,总量≥10μg的RNA;

       2 .OD260/280介于1.8~2.2之间,OD260/230≥2.0,RIN≥6.5,28S:18S≥1.0,确保RNA无降解;


cDNA样品

       1.样品需求量(单次): 建议送样量≥2μg,对于总量≥500ng的样本可以采用风险建库

       2.样品浓度: 最低10ng/μL

       3.样品纯度:OD260/280=1.80-2.00,RIN≥6.5


建库测序

       建库:去除rRNA链特异性建库,或者去除rRNA线性消化链特异性建库

       测序策略:Illumina PE测序(150×2)

       测序数据量:去除rRNA链特异性建库≥12G,线性消化建库6-8G

案例一

       本研究利用RNA-seq技术对猪胚胎6个不同发育阶段(E23、E42、E60、E80、E100和E115)的脑皮层进行了circRNA研究。通过对测序数据进行分析,共鉴定了9377个候选circRNA,其中表达量高于0.05 RPM(back-spliced reads per million raw reads)的有4634个,且circRNAs的数量随着发育的进行而增加,到E60期达到顶峰,随后出现锐减现象,这说明circRNAs在脑皮层发育的前期发挥重要作用。circRNA在不同发育阶段(E60和E115)不同脑组织(基底核、脑干、小脑和海马区)的表达也具有时空性,即在不同组织以及组织的不同发育阶段都不同,另外,在E60发育阶段表达的circRNAs的host gene主要与轴突导向、Wnt信号和TGF-β信号通路有关。


图1 CircRNA在不同脑组织(基底核、脑干、小脑和海马区)中的时空表达情况.

                                                          A.表达的circRNAs在不同脑组织中的数量分布

                                                          B. circRNAs在E60和E115时期的表达模式聚类图

                                                          C. CiRS-7(已知circRNA)在E60和E115时期不同组织中的表达


案例二 

       本研究利用RNA-seq技术,采用去除rRNA的方式建库分析来自6个正常组织(脑、结肠、心脏、肝、肺、胃)和7个癌症组织(膀胱尿路上皮癌、乳癌、结直肠癌、肝癌、胃癌、肾透明细胞癌、前列腺癌)的circRNA。研究发现了67,358个潜在的circRNA,其中27,296含有至少两个unique back-spliced reads。许多circRNA在正常组织与癌症组织中具有表达差异(图1),同时发现了一个丰富的环状RNA circHIPK3,来自 HIPK3 基因Exon2。沉默circHIPK3以后,发现人类细胞的生长受到显著的抑制。通过荧光素酶筛选实验发现,circHIPK3具有18个miRNA bind sites(图2)。circHIPK3能够直接结合 miR-124,抑制 miR-124的活性。


图1 circRNA的表达统计及其在正常组织与癌症组织中的表达丰度


图2 针对circHIPK3的荧光素酶筛选实验

 

参考文献

[1]Morten T. Venø, Thomas B. Hansen, Susanne T. Venø,et al. Spatio-temporal regulation of circular RNA expression during porcine embryonic brain development[J].Genome Biology, 2015, 16(1):1-17.

[2]Zheng Qiupeng, Bao Chunyang, Guo Weijie,et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs[J].Nature Communications, 2016, 7.

去除rRNA链特异性建库,与去除rRNA线性消化链特异性建库的优缺点?  

(1)去除核糖体,构建去rRNA文库,在此基础上使用生物信息学方法预测circRNA

       优点:不需要使用RNase R减少部分实验消耗,可以同时研究mRNA, lncRNA, circRNA。

       缺点:只能研究部分高表达的circRNA,无法大规模检测,需要较高的测序数据量准确度差。

        

(2)去除核糖体,使用RNase R去除线性RNA

       优点:circRNA检出量高, 是第一种方案的20倍circRNA鉴定准确度高。

       缺点:由于消除了线性RNA,mRNA,lncRNA与circRNA表达水平将会失真。

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