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环境微生态 微生物多样性 16S/18S/ITS/功能基因多样性测序

16S/18S/ITS/功能基因多样性测序 生信分析 技术参数 案例解读 常见问题 留言咨询

        微生物多样性测序(又称扩增子测序)是利用二/三代测序平台,对16S rDNA/18S rDNA/ITS/功能基因等特定区段PCR产物进行高通量测序,突破传统微生物不可培养的缺点,获得环境样本中的微生物群落结构、进化关系以及微生物与环境相关性等信息。

适用范围

       1. 医学领域:常见疾病与人体微生物的关系;

       2. 动物领域:肠道、瘤胃(如产甲烷菌类群)与动物健康/营养消化研究等;

       3. 农业领域:根际微生物与植物互作、农业耕作/施肥处理与土壤微生物群落等;

       4. 环境领域:雾霾处理、污水治理、石油降解、酸性矿水处理及海洋环境等;

       5. 特殊极端环境:极端环境条件下的微生物类群研究。

美吉优势      

       美吉I-Sanger生物信息云,引领行业的交互时代,实现全面、灵活、专业、安全的数据呈递方式。 

       采用定向测序技术,避免了非定向测序造成的数据冗余,能充分利用每条有效序列,且便于后期的菌群分类处理。

       环境微生物群落多样性分析有 Illumina PE250/300 和 PacBio平台两种高通量测序平台可供选择,根据不同的测序要求提供不同的解决方案。
       业务方向多元化,可提供微生物与环境,微生物与农牧业及微生物与健康等多领域服务。
       众多成功案例,强大技术支撑、个性方案设计使美吉生物在微生物群落多样性测序及分析方面处于国内领先地位。
       美吉生物利用各组学技术为客户在微生物领域发表文章300+篇,其中宏组学文章10+篇,累计影响因子1000+。

实验流程


生信分析流程图

技术参数

送样要求

土壤:10 g;粪便:3-5 g;血液:10 mL;污泥/沉积物:5-10 g

DNA:总量 ≥ 1 μg、浓度 ≥ 20 ng/μL1.8 < OD260/280 < 2.0

平台选择

 Illumina PE250/300PacBio平台

推荐测序量

土壤:2-3万;粪便:2-3万;肠粘膜:1-2万;胃液:1-2万;

水样:>1万;沉积物:>1万;皮肤表面:1-2



例一:原发性胆汁性胆管炎患者肠道菌群改变并可以在UDCA治疗后部分逆转

原发性胆汁性胆管炎(PBC)是最常见的一类自身免疫性肝病。PBC由于存在抗线粒体抗体(AMA),破坏肝内小胆管而导致胆管炎、肝纤维化和潜在的肝硬化。熊去氧胆酸(UDCA)是PBC的标准治疗,能够改善肝脏功能测试和减缓疾病进程。全基因组关联分析和小鼠模型研究扩展了我们对PBC的了解,但该疾病的发病机理仍不清楚。本文利用16S多样性测序技术分别对PBC患者与健康人肠道菌群进行检测,以期找出PBC初治患者与健康人肠道菌群的差异,以及UDCA干预对PBC患者肠道菌群的影响。


实验设计:

实验结果:


1 左图,PBC初治患者与健康人肠道菌群丰度距离箱式图;右图,基于unweighted unifracPCoA分析


2 左图,Wilcoxon秩和检验找出PBC初治患者与健康人有12种细菌物种丰度具有显著性差异;右图,根据左图找出的差异菌属建立肠道菌群分类器,经ROC分析证明此菌群分类器能够准确区分PBC和健康人


案例二:天然沸石或硝化抑制剂的添加对污泥堆肥过程中抗生素抗性基因的影响

 污泥堆肥作为有效的资源利用,堆肥污泥中大量的ARGs和他们的宿主菌和重金属接触时,重金属会对抗生素耐药菌有选择作用,选择机制尚不清楚,研究建立了(ABC)三个相同的实验室规模的反应器,探究天然沸石和硝化抑制剂对ARGs的影响以及重金属、MGEs(可遗传因子)和微生物群落对ARGs积累的程度。


实验设计:

实验结果:

1 左图,丰度前10位属构建的群落Heatmap图,其中ABC三组放线菌相对丰度分别为28.4%41.1%38.1%,表明天然沸石比硝化抑制剂更能促进堆肥腐熟度;右图,RDA分析结果可知,在不同的处理阶段这些作用因子对ARGs的作用不同。

图2 Network网络分析显示ARGs和它们的潜在的宿主菌的共存关系。紫色代表ARGs是增加的,绿色代表ARGs是减少的,连线代表呈现正相关(p<0.05)。点越大表示有关系的数量越多。紫色越深,表示ARG有更多的和其他之间的联系来增加ARGs,而绿色越深,表示ARG有更多的和其他之间的联系来减少表示ARGs


参考文献

[1]Ruqi Tang, et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy[J]. Gut, 2017.

[2]Junya Zhang, Meixue Chen, Qianwen Sui, et al. Impacts of addition of natural zeolite or a nitrification inhibitor on antibiotic resistance genes during sludge composting[J]. Water Research, 2016, 91: 339-349.


(1)采用Illumina高通量测序平台进行微生物多样性测序,应如何构建文库?

①连接“Y”字形接头;②使用磁珠筛选去除接头自连片段;③利用PCR扩增进行文库模板的富集;④氢氧化钠变性,产生单链DNA片段。


(2)抽平分析是否为群落多样性分析中必需环节,或可以增加群落组成分析的可靠度?

       抽平是指按照一定数量或样本序列最低数量,将所有样本的序列随机抽取至统一数据量。抽平不是必须环节。抽平一般是指样品的数据量差别比较大,为了后续结果的一致性,需要对样品的测序量进行随机抽取(取最低条数或某一指定序列条数),然后进行后续分析。当样本之间的数据量相差较大时,抽平分析的结果在统计学上更具有意义,现在一些杂志的编辑在审稿时会要求对数据进行抽平分析。


3Silva,RDPGreengene 三个数据库的特点及区别?OTU和数据库比对分类学信息时,序列相似度是多少?每个分类单元的相似度是多少?

三者区别见下图。比对数据库序列的置信度是0.7,同一OTU内序列相似度97%以上。


4分类学注释中,UnidentifiedNo_RankUnclassifiedOthers等,分别是什么意思?

Unidentified 

分类学比对时在设定的置信阈值以下reads或没有分类信息的reads 

No_Rank 

在某个分类学水平上没有明确的分类信息或分类名称。 

Unclassified 

在数据库中没有找到对应于该序列的分类信息 

Others 

自行定义,把丰度低于一定阈值的归到此项中


(5)PCAPCoA、NMDS的生物学意义及区别?    

       PCAPCoA、NMDS图都是反映样本间的差异和距离的,PCA是运用方差分解,将多组数据的差异反映在二维坐标图上,坐标轴为能够最大程度反映方差的两个特征值(主成分),如果样本组成越相近,反映在图中的距离越近。PCoA是通过一系列的特征值和特征向量进行排序,选择排在前几位的特征值,以此来描述和观察个体或群体间的差异。NMDS图是基于进化关系或数量距离矩阵,来描述样本间差异的。这三种图都是用于比较样本或样本组间差异的。通过样本点中的距离,体现样本间的差异程度。距离越大,差异越大。


(6)怎样对图片编辑和转换?

      分析图片推荐老师选择下载最原始的矢量图PDF格式,在修改过程中,分辨率不会发生改变,即扩大缩小均不影响清晰度。如果对图片进行编辑或格式修改等,推荐修图软件 AdobeIllustrator(AI),使用方法如下:

    ①下载并安装Adobe Illustrator(AI),最好是最新版本CS6(http://www.adobe.com/products/illustrator.html)。下载安装链接:http://pan.baidu.com/s/1i3syOXR     密码: h9t8

    ②打开AI,将要编辑的pdf文件拖入AI主界面,或者选择文件->打开,打开需要编辑的文件。

    ③编辑好pdf后选择文件->导出,在弹出的对话框中选择保存类型,有多种格式,比如(tiff格式)或者jpg格式等,点导出即可,根据文章要求还可以进行分辨率等的设置。

     在word中选择插入图片即可把生成的emf文件插入word中。


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