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       荧光定量PCR技术产生并成熟于上世纪90年代,由于该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃,能够对PCR反应的全过程进行实时监控,并且自动化程度高,所以该技术从产生到现在短短的十几年时间,在科研及检验领域获得了广泛的应用,成为分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。

荧光定量PCR利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析。


技术应用

       分析点突变和等位基因;

       基因表达的定量分析;

       DNA甲基化检测;

       单核苷酸多态性分析;

       定量定性分析传染病疾病。

 

美吉优势

       采用ABI7500荧光定量PCR仪,提供可靠的数据;

       专业的技术支持,从实验设计开始就能为您提供帮助;

       完整的实验报告,让您轻松分析实验结果;

       多台ABI7500,能够缩短实验周期,让您更快的得到实验结果。




技术路线


1、如果您寄送的是环境样本、污泥、土壤或者您抽提的是RNA样本,请以干冰的形式进行运输,以保证存放的温度接近于-80℃;

2、如提供实验材料为动物组织材料,样品质量需大于 2g;
     如提供实验材料为植物样品,样品质量需大于4g;
     如提供实验材料为培养细胞,请你提供个数大于1×107培养好的细胞;
     如提供实验材料为血液样品,请你提供≥2ml的样品。

3、请务必标注好您所要做的基因的名称、序列以及扩增产物的片段大小;


1.荧光定量的实验周期是多长?

       QPCR的实验周期一般是15-20工作日。具体实验周期视样本数量及检测基因个数而定。


2.PCR和QPCR有什么区别?
       ① 荧光定量 PCR (QPCR)能够实时监测 PCR 反应的全过程,对每一个循环进行定量定性分析;而普通 PCR 只能对反应的终产物进行半定量定性分析。
       ② QPCR 的结果分析可以直接通过电脑读出,而普通 PCR 的结果必须通过下一步的电泳条带分析。


3.绝对定量和相对定量有什么区别?

       荧光定量有两种定量类型,分别为绝对定量和相对定量。这两种定量方法的不同点在于:

       目的不同:绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目,即通常所说的拷贝数;相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例,而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数;

      实验方法不同:绝对定量必须使用已知拷贝数的标准品,必须做标准曲线;而相对定量可以做标准曲线,也可以不做标准曲线,仅利用Ct值的不同来分析实验结果。


4.绝对定量和相对定量的选择?

       绝对定量的标准曲线法和相对定量的比较Ct法是我们最擅长的两种实验方案。不论哪种方案,我们均采用染料法(即SYBR Green I)作为检测方法。

       标准曲线法,将标准品稀释至不同浓度,作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标,以测得的CT值为纵坐标,绘制标准曲线,对未知样品进行定量时,根据未知样品的CT值,即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。
       比较Ct法,也就是2^(-△△CT)法。其中△△CT=(待测组目的基因Ct值-待测组内参基因Ct值)-(对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值),因此,2^(-△△CT)表示实验组目的基因的表达相对于对照组的而变化倍数,使用这一方法可以直接得到目的基因相对于内参基因的量。比较CT法的优点是不需构建标准品,节省时间、试剂,缺点是必须确定待测基因和看家基因的的扩增效率,效率接近时结果才可靠,否则结果不能用。 


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