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蛋白质组学和代谢组学 定量蛋白质组学 SILAC

SILAC 生信分析 技术参数 案例解读 常见问题 留言咨询

        SILACstable-isotope labelling by amino acids in cell culture)技术,指利用含轻、中或重型同位素标记的必需氨基酸(主要是Lys和Arg)培养基培养多组细胞,标记细胞内新合成的蛋白质,一般培养5-6代,细胞中的蛋白质将都被同位素标记。比如A组和B组,A组是在包含正常氨基酸(light)的培养基中;B组的培养基则含有“重型(heavy)”的氨基酸,即稳定同位素标记的氨基酸。细胞5-6代后,稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到蛋白中,取代了原有的氨基酸,这样,两个蛋白之间就存在分子量的改变,而其它化学性质无异。然后将两组细胞混合,提取出蛋白质,质谱进行测定。通过比较质谱图中肽段信号峰的峰面积大小进行相对定量研究。该技术适用于细胞和动物的体内标记,具有系统误差小,定量准确,并且可以进一步寻找具有时效性变化的差异蛋白,更精准地研究刺激的作用机理等技术特点。

细胞实验流程


动物实验流程




技术平台

Triple TOF 5600, Q-Exactive, Orbitrap Fusion™ Tribrid™

技术优势

       高通量:可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质;

    定量精确:降低由于样品制备不同而造成的实验差异;

  线性定量范围广;   

  灵敏度更高:蛋白质需要量明显减少;

  重要的的体内标记技术,更接近样品真实状态,适用于培养细胞或者小鼠蛋白质表达动态变化研究。

应用领域

机理和调控机制研究 

动态过程中机制研究

疾病标志物的筛选  

用药及预后标志物筛选




生信分析


 送样要求

样品类型

样品要求(/组样品)

备注

蛋白质溶液

蛋白质总量≥300µg

重复实验则量翻倍,建议准备两份样品备用。

组织样品

样品总量≥0.1g

按照蛋白质组织提取效率(蛋白:组=7%

细胞样品

细胞数量≥107

胰酶消化,按细胞冻存标准离心收集细胞即可。

体液样品

清≥200µL,脑脊液≥200µL,尿液≥1mL ,泪液≥1mL.

 


案例:细胞信号通路中T细胞精氨酸甲基化的变化差异

          本文研究精氨酸甲基化在免疫调节中的作用,通过异甲硫氨酸甲酯的SILAC培养基培养人T细胞进行实验,共鉴定到了1257个看家蛋白质的2502个精氨酸甲基化位点,发现精氨酸甲基化转移酶在T细胞活化和分化过程中起到了关键作用




参考文献:

       Geoghegan, V., et al. (2015) Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling. Nature communications 6, 6758.




1、SILAC技术试用的范围有哪些?

      SILAC能标记活的可传代细胞、细菌等材料,不能标记组织、体液等样本。


2、SILAC技术与iTRAQ技术有何差异?

      两种标记技术的比较如下:

      1.SILAC定量主要是一级质谱定量,iTRAQ主要是二级质谱定量。

      2.SILAC是体内标记,需要在进行材料培养的时候就加入标记,主要使用在动物或植物细胞培养的过程中,针对其它类型的组织等样品就不适用,但是iTRAQ是体外标记,是将蛋白提取后再进行标记,可以适用于几乎所有材料样品。

      3.两者的定量准确性及蛋白分辨率方面应该差别不是很大。

      4.由于SILAC需要进行培养的过程中添加标记,所以需要比较长的时间才能比较彻底地标记



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