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蛋白质组学和代谢组学 定量蛋白质组学 蛋白质绝对定量MRM/PRM

蛋白质绝对定量MRM/PRM 技术参数 案例解读 留言咨询

      由于同一个样本中的不同蛋白和肽段离子化效率不同,绝对定量的信息获取具有很大挑战。多反应监测multiple reaction monitoring, MRM技术是一种基于已知或假定的反应离子信息,有针对性地选择数据进行质谱信号采集,对符合规则的离子进行信号记录,去除不符合规则离子信号的干扰,通过对数据的统计分析从而获取质谱定量信息的质谱技术。利用质谱多反应监测技术与同位素稀释相结合,通过对比已知浓度的标记标准品与待测样品目标离子峰面积信息,从而推算分析物含量。

       平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring,PRM)属于靶向MS/MS分析,在整个液相分离过程中会不断地对每一个目标母离子的全部碎片离子图谱进行记录。相比于传统SRM只检测目标离子对的模式,PRM检测所选择的母离子窗口内的所有碎片信息。在文献中,在Q Exactive质谱上进行的该分析模式被称为PRM,而在LTQ线性离子阱或LTQ-Orbitrap质谱上则被称为SRM。相比而言,四极杆的优势在于离子分离速度和效率更高,以及能够使用多重单离子监视(SIM),而且制造成本更低。PRM主要的优势就是使用了超高分辨率的Orbitrap质量分析器,其能够将干扰信息与真实的信号进行区分,以及相比于传统的SRM方法能够更好的保证分析的选择性。其缺点是能够监视的母离子的数量取决于Orbitrap分析器的工作循环或瞬时长度以及色谱条件。虽然,其数量能够通过利用time-scheduling、parallelization和降低Orbitrap的分辨率来增加。PRM方法曾被用于定量酵母细胞裂解液中的10个聚泛素肽链。与早期的研究结果一致,该方法的动态范围至少有3个数量级,其定量误差<10%。而且无论是分选宽度还是基质干扰都不会改变其定量准确性。最低检测限低于0.1 amol。数据处理可采用Skyline分析。



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实验流程




技术平台

       Triple TOF 5600, Q-Exactive, Orbitrap Fusion Tribrid

技术优势

       灵敏度高

       重现性好

       准确度高

       通量高

应用领域

       标志物的验证和绝对定量研究

       翻译后修饰等缺乏抗体的特殊蛋白质和肽段的验证和绝对定量研究

       基因突变、可变剪切、基因表达多态性在蛋白质表达方面的确证和定量

       极低丰度蛋白质的靶向检测




送样要求

样品类型

样品要求(/组样品)

备注

蛋白质溶液

蛋白质总量≥300µg

重复实验则量翻倍,建议准备两份样品备用。

组织样品

样品总量≥0.1g

按照蛋白质组织提取效率(蛋白:组=7%

细胞样品

细胞数量≥107

胰酶消化,按细胞冻存标准离心收集细胞即可。

体液样品

清≥200µL,脑脊液≥200µL,尿液≥1mL ,泪液≥1mL.

 


案例:筛选乳腺癌转移的生物标记物

       结合shotgun技术与靶向性的MRM技术,筛选可以作为乳腺癌生物标记物或者治疗靶标的乳腺癌转移相关蛋白质。利用label free N-糖基化蛋白质定量技术,鉴定到778个蛋白质的1515个糖基化肽段。结合MRM技术,发现10个蛋白质的在转移的乳腺癌组织中异常表达。最后验证发现5个潜在的乳腺癌转移的生物标记物。

 


参考文献:

       Sjostrom, M., et al. (2015) A Combined Shotgun and Targeted Mass Spectrometry Strategy for Breast Cancer Biomarker Discovery. Journal of proteome research 14, 2807-2818.



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