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基因表达调控 转录组 互作转录组

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       物种间存在广泛的相互作用,包括寄生、共生、竞争等,而普通的转录组只能研究单一物种的信息,不仅浪费一部分数据,而且在分离中也会对样本本身造成一定的影响。而互作转录组,无需分离两物种,避免分离造成的干扰,只构建一个转录组文库便可得到两物种的信息。同时,还可以通过互作模型图获得物种间基因的调控关系,得到两物种间的相互作用机制。

 

美吉优势

       1. 独具特色的取样建库流程,有效提高侵染物种的数据量;

       2. 新增研发分析内容,更好揭示物种间相互作用关系 ; 

       3. 经验丰富的技术和生信分析团队,并有强大的计算机平台作支撑; 

       4. 从实验方案设计到后期数据挖掘,全面助力您的科学研究。 

应用范围

      1. 植物病害与抗病感病机理

      2. 生理适应与分子响应

      3. 病原菌入侵与宿主免疫

      4. 物种间共生机理

      5. 物种共进化

组织样品 

        1. 动物组织:>2g 

        2. 植物组织:>4g 

        3. 细胞培养:>1*107

        4. 血液样品:≥2ml 

        5. 菌体沉淀:2-4ml (密度约1*107个/ml,对数期或稳定初期) 

RNA样品 

        1. 真核样本请提供浓度≥50ng/μL,总量≥2μg的RNA(单次建库用量为1μg),原核样本请提供浓度≥100ng/μL,总量≥4μg的RNA(单次建库用量为2μg),对于总量不足常规建库但多于10ng的样本可以采用微量建库; 

        2. OD260/ 280介于1.8 ~ 2.2之间,OD260/230≥2.0,RIN值≥6.5,28S:18S≥1.0,确保RNA无降解; 

        3. 送样时请标记清楚样品编号,管口使用Parafilm膜密封; 

        4. 样品保存期间切忌反复冻融; 

        5. 送样时请使用干冰运输; 

测序量

        1. 真核对照样本参照真核转录组测序量,为6G clean data

        2. 原核对照样本参照原核转录组测序量,为2G clean data

        3. 真核-真核、真核-原核互作样本转录组测序量,为10G clean data(具体可视情况而定)。

建库方式

        1. 真核-真核互作转录组测序一般采用ployA富集方式得到mRNA

        2. 真核-原核互作转录组测序一般采用去除核糖体RNA方式得到mRNA

案例1 沙门氏菌感染人细胞系

美国、奥地利和德国学者利用dual RNA-seq技术,以沙门氏菌和人细胞系为互作模型,研究了细菌sRNA与宿主基因的作用机制。沙门氏菌感染宿主细胞0h4h24h后,对宿主细胞和沙门氏菌基因进行分析。研究发现,沙门氏菌sRNA中的PinT上调最为明显,同时PinTPhoP调控;此外,PinT可以调控自身毒力相关基因SPI-1下调、存活相关基因SPI-2上调,而SPI-2可以调控宿主JAK–STAT信号通路上调。

 

图 沙门氏菌侵染宿主后两者相互作用模式

案例2 灰葡萄孢菌染莴苣

       B. Cinerea侵染L. Sativa 12h24h48h后,进行转录组测序。测序数据与参考基因组mappingmappingL. Sativa参考基因组的比率为77%左右,而mappingB. Cinerea参考基因组的比例随着侵染时间延长而升高,其中在侵染后48h5.5%。侵染的三个时期中,病原菌与宿主中共检测到11394598个差异变化基因,占总注释到基因的44%。通过GO富集发现,宿主中上调的基因大都与植物防御病原菌相关。

                                    不同侵染时期基因表达水平heatmap                           侵染48h后代谢通路变化


参考文献

1. Westermann A J, Förstner K U, Amman F, et al. Dual RNA-seq unveils noncoding RNA functions in host–pathogen interactions[J]. Nature, 2016, 529(7587).

2. De C K, Mathys J, Vos C, et al. RNAseq-based transcriptome analysis of Lactuca sativa infected by the fungal necrotroph Botrytis cinerea[J]. Plant Cell & Environment, 2013, 36(11):1992–2007.

1. 互作转录组相对普通转录组有何优势?

       互作转录组是针对两种或两种以上具有相互作用的物种,一般互作方式包括共生、寄生、竞争以及捕食等。普通转录组需要对两种物种分离,但是会浪费部分信息并会带来其他的影响,而互作转录组可同时研究两种或更多的物种,无需分离,排除分离带来的影响;成本更低,只构建一个转录组文库,便可同时分析两个物种,最终得到两个物种基因间的调控关系。

2. 两个互作物种必须都有参考基因组吗?

       理论上,最好是两个物种都有参考基因组,得到的结果更准确。但是也有文献报道,互作样本中只有一个物种有参考基因组,其分析流程是先将测序数据与有参考基因组物种进行mapping,将mapping数据剔除后的转录组数据,可以选择与近缘物种mappingdenovo拼接的方式得到另一物种的信息,进一步进行分析。但是对于互作样品中的原核部分必须有参考基因组,如果没有参考基因组,可以通过细菌扫描图实现。

3. 互作物种中,侵染的物种可能数据量会很少,如何获得侵染物种比例或提高侵染物种比例?

        一般情况下,宿主细胞被侵染的占比会很少,但是一个细胞中可能会被多个细菌侵染。以细菌为例,文献报道平均为1个细胞中感染1-20个左右的细菌不等,也视情况而定。如何在测序前获得侵入宿主细胞的比例,宿主与感染菌的RNA占比,可以通过前期的qRT-PCR实验检测保守基因或者显微镜观察等其他试验获得;而对于提高病原菌比例,可以在取样时尽量选择病斑位置或通过延长侵染时间以提高病原菌比例,另外也可以通过荧光标记等方式分离已入侵的细胞从而提高侵染物种比例。

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